供应全基因敲除小鼠

全基因敲除小鼠的制备原理 

全基因敲除(conventional knockout)是将目标基因用一段外源DNA序列(多数情况下是用于药物筛选的新霉素(Neomycin)抗性基因)来取代，从而达到使目的基因失活的目的。

用于全基因敲除的打靶质粒构建相对简单。一般有一个阳性筛选基因（比如NeoR, Hygromycin Resistant Gene)和一个阴性筛选基因（如TK、DTA)。阳性筛选基因位于两个同源臂的中间，阴性筛选基因一般位于一个同源臂的外侧。阳性筛选基因类似于分子生物学实验中质粒上的氨苄等抗性基因。在转染小鼠胚胎干细胞之前，一般要对打靶载体进行线状化，然后利用电转仪通过电转的方式将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞内。线状打靶载体会整合到染色体上。在抗生素（比如G418）存在的情况下，只有染色体上重组了打靶载体的胚胎干细胞才能成活并增殖。如果是同源重组，阴性筛选基因会丢失，导致不能表达。如果是随机插入，一般会保留同源臂外的阴性筛选基因。

传统上阴性筛选基因一般是用来自于HSV的胸苷激酶基因TK，这种激酶会将Gancyclovir转变成一个核苷类似物，并在基因组复制的过程中整合到新合成的DNA链上，造成DNA复制停止。所以，Gancyclovir能够抑制打靶载体随机插入的胚胎干细胞增殖。由于Gancyclovir经常会影响得到嵌合体小鼠后的种系传递，所以现在打靶载体很少再用TK基因做为阴性筛选基因了。目前最常用的是DTA(Diphtheria Toxin Subinit A, 白喉毒素A亚基）。在随机插入的情况下，如果有DTA表达，DTA可以直接杀死细胞，不需要再通过加入Gancyclovirs的方式进行阴性筛选。